Dzimis Argentīnas galvaspilsētas Buenosairesas Barakasas rajonā, vecākais no trim bērniem. Kopš 1950. gada bija precējies ar Sāru Freitesu (Sara Freites Varela), ar kuru kopā izaudzināja sešus bērnus, laulībā pavadot vairāk nekā pusgadsimtu, līdz dzīvesbiedre mira 2005. gadā.

1945. gadā tikko pēc 19 gadu sasniegšanas A. di Stefano debitēja vienā no populārākajiem Argentīnas klubiem River Plate, kur 1947. gadā jau kļuva par valsts čempionāta rezultatīvāko spēlētāju. 1948. gadā Argentīnā izcēlās futbolistu streiks, un A. di Stefano devās spēlēt uz Kolumbijas līgu, pievienojoties Bogotas klubam Millonarios. Četrās sezonās izcīnījis trīs Kolumbijas čempionu titulus, 1953. gada septembrī A. di Stefano pārcēlās uz Spāniju. Par argentīnieti izvērsās sīva cīņa starp abiem vadošajiem Spānijas klubiem Madrides Real un Barcelona, kuri abi pretendēja uz futbolistu, bet beigās Barcelona par kompensāciju atteicās no savām pretenzijām.

Madrides Real sastāvā A. di Stefano uzreiz izvirzījās par vienu no komandas līderiem, jau pirmajā sezonā kļūstot par Spānijas līgas rezultatīvāko spēlētāju un palīdzot “Karaliskajam klubam“ pēc 21 gada pārtraukuma atgriezties valsts čempionu godā. A. di Stefano Real rindās aizvadīja 11 sezonas (1953–1964), kopumā izcīnot astoņus valsts čempionu titulus, kā arī piecas reizes kļūstot par līgas rezultatīvāko spēlētāju. Šajā laikā Real arī dominēja starptautiskajā arēnā jeb jaunizveidotajā Eiropas valstu spēcīgāko klubu kontinentālajā turnīrā Eiropas kausā (European Cup), kur Madrides klubs triumfēja pirmajos piecos turnīros pēc kārtas (1956–1960). A. di Stefano bija tikai viens no trim Real spēlētājiem, kas piedalījās visos piecos šajos triumfos, gūstot arī vārtus visos piecos uzvarētajos finālmačos. Pavisam Eiropas kausā A. di Stefano 58 spēlēs guva 49 vārtus, kas ilgu laiku bija galvenā kontinenta klubu turnīra rezultativitātes rekords. Savukārt Spānijas čempionātā Real labā argentīnietis 282 spēlēs guva 216 vārtus, kas ilgus gadus bija kluba rekords.

1964. gada vasarā A. di Stefano pārcēlās uz Barselonas klubu Espanyol, aizvadot tur divas sezonas. 1966. gadā A. di Stefano beidza spēlētāja karjeru, taču 1967. gada jūnijā Real vēl sarīkoja futbolista atvadu spēli pret tā brīža Eiropas kausa ieguvējiem Skotijas klubu Glāzgovas Celtic (0:1).

Aizvadījis spilgtu karjeru Eiropā, A. di Stefano pavisam maz spēlēja Argentīnas izlasē. 1947. gada decembrī viņš debitēja valstsvienībā, Dienvidamerikas čempionātā sešos mačos gūstot tikpat vārtu un palīdzot argentīniešiem kļūt par kontinenta čempioniem. Tās izrādījās A. di Stefano vienīgās spēles Argentīnas izlasē. Pēc šī turnīra Argentīna vairākus gadus boikotēja starptautiskās sacensības, bet A. di Stefano pārcēlās uz Kolumbiju, kur aizvadīja vairākas neoficiālas spēles vietējās līgas izlasē. Tā kā Starptautiskā Futbola asociāciju federācija (Fédération Internationale de Football Association, FIFA) neatzina Kolumbijas līgu, A. di Stefano bija aizliegts spēlēt Argentīnas izlasē, kurš tāpat atteicās piedalīties 1950. un 1954. gada Pasaules kausā.

1956. gadā A. di Stefano ieguva Spānijas pilsonību, drīz vien saņemot atļauju spēlēt šajā valstsvienībā. 30.01.1957. A. di Stefano debitēja Spānijas izlasē, uzreiz gūstot trīs vārtus pārbaudes mačā ar Nīderlandi (5:1). Tomēr Spānijas valstsvienība nekvalificējās 1958. gada Pasaules kausa finālturnīram, kvalifikācijas grupā palaižot sev priekšā Skotiju. Spānija ieguva tiesības spēlēt 1962. gada Pasaules kausa finālturnīrā Čīlē, uz kurieni A. di Stefano devās kopā ar komandu, taču čempionāta priekšvakarā guva muskuļa savainojumu un tā arī nevienā mačā neizgāja laukumā.

Lai arī parasti saukts par centra uzbrucēju, A. di Stefano bija universāls spēlētājs, regulāri atgriežoties pēc bumbas laukuma dziļumā un organizējot spēli vidējā līnijā.

A. di Stefano guva labus panākumus arī trenera arodā, izcīnot Argentīnas čempiona titulus ar abiem slavenajiem Buenosairesas klubiem Boca Juniors (1959) un River Plate (1981), kā arī aizvedot līdz Spānijas čempionu titulam klubu Valencia (1971), ar ko viņš tika arī pie starptautiska panākuma, 1980. gadā izcīnot Eiropas Kausu ieguvēju kausu (European Cup Winner`s Cup). 1982. gadā A. di Stefano kļuva par Madrides Real galveno treneri, bet divās sezonās komandai pietrūka viena punkta, lai kļūtu par valsts čempioniem. 2000. gadā Real iecēla savu ievērojamo spēlētāju par kluba goda prezidentu. 07.07.2014. A. di Stefano 88 gadu vecumā mira pēc sirdstriekas, bet atvadīšanās no futbolista notika Madrides Santiago Bernabeu stadionā.

2000. gadā FIFA sarīkotajā balsojumā par 20. gs. labāko futbola spēlētāju (FIFA Player of the Century) speciālistu žūrijas vērtējumā A. di Stefano izpelnījās otro vietu aiz brazīlieša Pelē (Pelé). 1998. gadā A. di Stefano iekļāva 20. gs. simboliskajā komandā (World Team of the 20th Century), ko izvēlēja 250 sporta žurnālisti no visas pasaules, bet 2013. gadā viņš iekļuva arī populārā specializētā britu žurnāla World Soccer visu laiku simboliskajā vienpadsmitniekā (Greatest XI of All Time). A. di Stefano divas reizes saņēmis Eiropas sezonas labākā spēlētāja balvu “Zelta bumba” (Ballon d`Or, 1957, 1959), bet 1989. gadā viņš arī ieguva “Zelta bumbas” pasniedzēju franču žurnāla France Football īpašo balvu Super Ballon d’Or labākajam iepriekšējo trīs desmitgažu Eiropas futbola spēlētājam. 2003. gadā par godu Eiropas Futbola asociāciju savienības (Union of European Football Associations, UEFA) 50 gadu jubilejai veiktajā aptaujā A. di Stefano atzina par 50 gadu (1954–2003) Spānijas “Zelta spēlētāju” (Golden Player). 1994. gadā A. di Stefano saņēma FIFA augstāko apbalvojumu par nopelniem (FIFA Order of Merit).

2006. gadā Madridē tika atklāts futbolista vārdā nosaukts stadions Estadio Alfredo di Stéfano, kur spēlē Real rezerves un sieviešu komandas. Šajā kluba treniņbāzē ir arī uzstādīta A. di Stefano veltīta bronzas statuja.

2000. gadā spāņu valodā iznāca A. di Stefano autobiogrāfija “Paldies, vecā sieva: Futbola lielākā mīta atmiņas” (Gracias, vieja: Las memorias del mayor mito del fútbol). A. di Stefano spēlēja galveno lomu režisora Floriana Reja (Florian Rey) 1956. gadā iznākušajā spēlfilmā “Blondā bulta” (Saeta rubia), kur viņš attēloja pats sevi.