Optiskās mikroskopijas pamatprincipus skaidro optika. Optiskā starojuma gaitu mikroskopā un attēla veidošanos apraksta ģeometriskā optika. Ģeometriskās optikas pamatpieņēmumi ir:
Gaismas laušana ir fizikāla parādība, kas izpaužas kā gaismas staru virzienu maiņa, tiem pārejot starp vidēm ar atšķirīgiem gaismas laušanas koeficientiem. Gaismas laušanu raksturo Snelliusa likums (Snellius law). Gaismas laušanas parādība tiek izmantota lēcās, lai kontrolētu staru gaitu optiskajās sistēmās. Izšķir lēcas, kas ienākošu staru kūli fokusē (savācējlēcas, arī izliektas vai pozitīvas lēcas), un lēcas, kas izkliedē (izkliedētājlēcas, arī ieliektas vai negatīvas lēcas). Fizikālais lielums, kas raksturo lēcas gaismas staru lauztspēju, ir optiskais stiprums, un tas ir apgriezti proporcionāls lēcas fokusa attālumam.
Vienkāršāko salikto (compound) gaismas mikroskopu cilindriskajos tubusos tiek izvietotas divas lēcas – okulārs un objektīvs ‒, kamēr modernos gaismas mikroskopos var tikt veidotas sarežģītas lēcu sistēmas, kas nodrošina palielinājumu pat līdz 1000 reizēm.
Eksistē fundamentāls ierobežojums optiskās mikroskopijas izšķirtspējai d neatkarīgi no lēcu sistēmas sarežģītības gaismas difrakcijas parādības dēļ. To nosaka Releja kritērijs (Rayleigh criterion):
Ņemot vērā, ka redzamās gaismas viļņa garums ir 400‒700 nm robežās, bet tipiskas skaitliskās apertūras vērtības ir ap 1, augstākā izšķirtspēja, ko var nodrošināt standarta gaismas mikroskops, ir aptuveni 200 nm. Mūsdienās ir vairākas optisko mikroskopu realizācijas, kurās gaismas difrakcijas izšķirtspējas ierobežojums ir pārvarēts.
Atsevišķos optisko mikroskopu veidos tiek izmantots tas, ka gaismu veido atšķirīgu elektromagnētisko viļņu polarizāciju superpozīcija. Par polarizāciju sauc fizikālas parādības izpausmi kādā noteiktā virzienā. Gaismas gadījumā tās ir elektriskā un magnētiskā lauka svārstības, kas norisinās perpendikulāri gaismas viļņa izplatīšanās virzienam. Gaismas izplatīšanos elektromagnētiska viļņa veidā apskata viļņu optika (fizikālā optika).
Fluorescences mikroskopijā papildus jāņem vērā kvantu optikas atziņas, kas skaidro gaismas kvantu – fotonu – mijiedarbību ar vielu. Fluorescence ir fizikāla parādība, kuras rezultātā vielu veidojošie atomi pēc to ierosināšanas izstaro elektromagnētisko starojumu, parasti redzamās gaismas diapazonā.