Zinātnes apakšnozare, kurā izmanto gaismas mikroskopus, ir optiskā mikroskopija. Optisko mikroskopu darbības principus skaidro optika. Optiskā starojuma gaitu mikroskopā un attēla veidošanos apraksta ģeometriskā optika. Mikroskopa izšķirtspējai tuvojoties teorētiskajai robežai, kā arī atsevišķos mikroskopu veidos svarīgi ir viļņu optikas jēdzieni “elektromagnētisks vilnis”, “polarizācija”, “fāze”, “interference” un “difrakcija”. Lai saprastu fluorescences mikroskopu darbības principus, jāorientējas kvantu optikas atziņās. Digitālo gaismas mikroskopu sastāvā ir cietvielu elektronikas ierīču komponentes, kuru fizikālos darbības principus skaidro pusvadītāju fizika.
optiskais mikroskops
optisks instruments sīku objektu pētīšanai, izmantojot elektromagnētisko starojumu redzamās gaismas diapazonā
Saistītie šķirkļi
Optiskais mikroskops.
Satura rādītājs
Iedalījums
Kritēriji, pēc kuriem var klasificēt optiskos mikroskopus, ir dažādi. Pēc uzbūves izšķir vienkāršus (simple microscope) un salikta tipa mikroskopus (compound microscope). Vienkāršo mikroskopu sastāvā ir viena lēca, kas darbojas līdzīgi kā palielināmais stikls, kamēr saliktu mikroskopu optisko sistēmu veido vairākas lēcas vai to sistēmas. Digitālie mikroskopi ir optisko mikroskopu variācijas, kuros papildus ietverta elektronikas sistēma attēla detektēšanai, attēlošanai uz ekrāna un saglabāšanai.
Mikroskopus iedala arī pēc parauga izgaismošanas metodes. Gaismu caurlaidīgiem objektiem piemērota ir caurejošā starojuma (transmitted light) optikas sistēma, kur paraugs parasti tiek izgaismots no apakšas, bet skatīts – no augšas. Sīkāk izšķir tradicionālo gaišā lauka (bright field) apgaismošanas tehniku, kur objekts izskatās tumšs uz gaiša fona, un tumšā lauka (dark field) tehniku, kur pētāmā objekta nianses tumšā redzes laukā izskatās gaišas. Necaurspīdīgu paraugu pētījumiem piemēroti ir atstarošanās (reflected light) tipa mikroskopi.
Specializēti gaismas mikroskopu veidi, kurus mūsdienās izmanto pētniecībā, ir polarizētās gaismas mikroskopi (polarized light microscope), fāžu kontrasta mikroskopi (phase contrast microscope), fluorescences mikroskopi (fluorescence microscope), konfokālie mikroskopi (confocal microscope), skenējošie tuvā lauka optiskie mikroskopi (scanning near field optical microscope, SNOM) un citi.
Izgudrošanas un attīstības vēsture
Pirmais mikroskops tika izveidots ap 16. gs., taču nav viennozīmīgi skaidrs tā autors. Holandiešu lēcu izgatavotāji bija specializējušies ierīču izgatavošanā objektu apskatīšanai palielinājumā, un briļļu meistari Hanss Jansens (Hans Janssen) ar dēlu Zahariju Jansenu (Zacharias Janssen) tiek uzskatīti par pirmā saliktā tipa mikroskopa izgudrotājiem. Mikroskopu izmantošana pētniecībā 17. gs. sekmēja revolucionāru zinātnes uzplaukumu.
Viens no mikroskopijas aizsācējiem bija nīderlandiešu tirgotājs un zinātnieks Antonijs van Lēvenhuks (Antonie Philips van Leeuwenhoek). Auduma diegu kvalitātes noteikšanai viņš izveidoja vienkāršu sistēmu ar sfērisku lēcu, kas nostiprināta nelielas misiņa plāksnes caurumā. Paraugs tika uzmontēts uz metāliskas spices, kuras pozīciju attiecībā pret lēcu varēja kontrolēt ar divu skrūvju palīdzību. Ierīce bija neliela un grūti lietojuma, taču tā nodrošināja pat līdz 300 reizēm lielu palielinājumu, kas bija par kārtu vairāk nekā tā laika labākajiem saliktajiem gaismas mikroskopiem. Lai gan A. Lēvenhukam nebija formālas izglītības zinātnē, viņš pievērsās arī mikropasaules izzināšanai. Pēc ilgstošiem dažādu šķidrumu un plānu augu un dzīvnieku izcelsmes paraugu novērojumiem tika veidoti detalizēti zīmējumi un apraksti, par kuriem kopš 1673. gada viņš rakstīja vēstules Londonas Karaliskajai sabiedrībai (Royal Society of London). A. Lēvenhuks atklāja vienšūņus un baktērijas, tādēļ tiek uzskatīts par mikrobioloģijas aizsācēju.
1664. gadā tika publicēta britu izgudrotāja Roberta Huka (Robert Hooke) grāmata “Mikrogrāfija” (Micrographia), kas piesaistīja plašu uzmanību mikroskopam kā neatņemamam instrumentam pētniecībā. Grāmatā bija iekļautas detalizētas sīku kukaiņu – mušu, blusu, utu – morfoloģijas un augu anatomijas ilustrācijas, kas iedvesmoja daudzus pētniekus pievērsties mikroskopijai. R. Huks apzinājās vienkāršo mikroskopu priekšrocības, taču savos pētījumos deva priekšroku saliktam mikroskopam, par gaismas avotu izmantojot eļļas lampu.
Būtiskākais trūkums, kas ierobežoja salikto optisko mikroskopu izmantošanu pētniecībā 18. gs., bija attēlu zemā kvalitāte lēcu sistēmas aberāciju dēļ. 19. gs. 30. gados problēmu daļēji novērsa britu fiziķis Džozefs Džeksons Listers (Joseph Jackson Lister), izveidojot ahromatisku objektīva sistēmu. Vairākus risinājumus aberāciju samazināšanai 19. gs. vidū ierosināja itāļu zinātnieks Džovanni Batista Amiči (Giovanni Battista Amici). Tālāku optisko mikroskopu attīstību būtiski sekmēja vācu fiziķa Ernsta Karla Abes (Ernst Karl Abbe) teorētiskās atziņas par gaismas difrakcijas lomu attēla veidošanā. Viņš strādāja vācu zinātnieka un uzņēmēja Karla Ceisa (Carl Zeiss) kompānijā, kas bija specializējusies optisko instrumentu ražošanā zinātnes pielietojumiem. Uz savu teorētisko atziņu pamata 1872. gadā E. Abe izgudroja kondensoru optimālai parauga izgaismošanai, bet 1886. gadā tika demonstrēti apohromatiski objektīvi, ar kuriem bija iespējams iegūt augstākas izšķirtspējas attēlus. 1893. gadā vācu profesors Augusts Karls Johans Valentīns Kēlers (August Karl Johann Valentin Köhler) izstrādāja uzlabotu sistēmu vienmērīgai parauga izgaismošanai – Kēlera apgaismojumu (Köhler illumination) ‒, kas vēl joprojām tiek izmantota mūsdienu optiskajos mikroskopos. A. Kēlers, strādājot K. Ceisa uzņēmumā, 1904. gadā izveidoja pirmo ultravioletā starojuma mikroskopu un novēroja, ka atsevišķi objekti luminiscē ultravioletā starojuma iedarbības rezultātā. Viņš to aprakstīja kā nevēlamu blakusefektu. Tas kalpoja par pamatu pirmajiem fluorescences mikroskopiem, pie kuru izveides 1911.‒1913. gadā neatkarīgi strādāja vācu fiziķi Oto Heimstets (Otto Heimstaedt) un Heinrihs Lēmans (Heinrich Lehmann).
Daudziem bioloģiskiem paraugiem mijiedarbība ar gaismu ir neliela, līdz ar to objektu struktūras detaļas bieži ir grūti izšķiramas, tādēļ turpmākā mikroskopu attīstība balstījās uz jaunu metožu izstrādi attēla kontrasta uzlabošanai. 1934. gadā holandiešu zinātnieks Fritss Zernike (Frits Zernike) izveidoja fāžu kontrasta mikroskopu, kurā gaismas viļņu amplitūdu pastiprināšanos vai pavājināšanos nodrošināja atšķirīgas viļņu fāžu nobīdes. Fāžu kontrasta mikroskopija pavēra iespējas mikrobioloģijā dzīvu objektu pētījumiem bez krāsošanas vai fiksēšanas. Par fāžu mikroskopa izgudrošanu F. Cernike 1953. gadā saņēma Nobela prēmiju fizikā. 20. gs. strauji attīstījās fluorescences mikroskopijas metodes, ko galvenokārt sekmēja fluorescentu krāsvielu (fluoroforu) atklāšana. Šīs krāsvielas spēj piesaistīties nepieciešamajām pētāmā parauga šūnu vai molekulu funkcionālajām grupām. Par zaļā fluorescējošā proteīna (green fluorescent protein, GFP) atklāšanu 1962. gadā japāņu ķīmiķim Osamu Šimomuram (下村 脩) un par darbu pie uzlabojumiem tā pielietojamības veicināšanā amerikāņu zinātniekiem Martinam Čalfijam (Martin Lee Chalfie) un Rodžeram Cjenam (Roger Yonchien Tsien) piešķirta 2008. gada Nobela prēmija ķīmijā. Otrs sekmējošais faktors fluorescento mikroskopu attīstībā bija holandiešu zinātnieka Johana Sebastiana Plēma (Johan Sebastiaan Ploem) 20. gs. 60. gados izstrādātais dihroiskais spogulis fluorescences signāla atdalīšanai no ierosinošā ultravioletā starojuma. Pirmo konfokālo mikroskopu 1961. gadā izveidoja amerikāņu zinātnieks Mārvins Lī Minskis (Marvin Lee Minsky), kas ir moderno lāzerskenējošo konfokālo mikroskopu pamatā telpiskiem šūnu uzbūves un funkcionalitātes pētījumiem. Mūsdienu optiskajos mikroskopos ir izdevies pārvarēt gaismas viļņa garuma noteikto izšķirtspējas ierobežojumu. Par ieguldījumu augstas izšķirtspējas fluorescences mikroskopu izveidē zinātniekiem Ērikam Bercigam (Eric Bertzig), Viljamam Mērneram (William Moerner) un Štefanam Hellam (Stefan Walter Hell) 2014. gadā tika piešķirta Nobela prēmija ķīmijā.
A. Lēvenhuka vienkāršais mikroskops (kopija).
Ierīces raksturojums un darbības principi
Mikroskops ir instruments smalku detaļu aplūkošanai pētāmā objektā, un tas veic vairākas funkcijas: nodrošina objekta palielināta attēla veidošanos (raksturlielums – palielinājums), telpiski atdala detaļas attēlā (raksturlielums – izšķirtspēja) un padara detaļas atšķiramas cilvēka redzei vai sensoram (raksturlielums – kontrasts). Optiskā mikroskopa galvenais elements ir lēca – caurspīdīgs ķermenis ar liektām virsmām gaismas staru gaitas izmainīšanai. Lēcu darbības pamatā ir gaismas staru laušanas parādība, tiem pārejot starp vidēm ar atšķirīgiem gaismas izplatīšanās ātrumiem. Gaismas staru fokusēšanai mikroskopos izmanto savācējlēcas (tās sauc arī par izliektām vai pozitīvām lēcām), kas paralēlu staru kūli sakopo vienā punktā – lēcas fokusā.
Vienkāršos mikroskopos tiek izmantota viena savācējlēca ar īsu fokusa attālumu. Ja starp savācējlēcu un tās fokusu novieto priekšmetu, tad lēcas tajā pašā pusē izveidojas šķietams, tiešs un palielināts priekšmeta attēls. Šķietamo attēlu nevar projicēt uz ekrāna, taču tas ir detektējams ar aci, kameru vai citu optisko sensoru.
Salikta tipa mikroskops vienkāršākajā realizācijas variantā sastāv no divām virknē izkārtotām savācējlēcām. Lēcu, kas atrodas tuvāk paraugam, sauc par objektīvu. Objektīvs projicē apgrieztu reālu un palielinātu attēlu mikroskopa cilindriskajā tubusā. Lēcu, pa kuru skatās novērotājs, sauc par okulāru. Tā uzdevums ir nodrošināt papildu palielinājumu objektīvā projicētajam attēlam. Tādējādi divpakāpju palielināšanas rezultātā tiek iegūts šķietams un apgriezts sākotnējā priekšmeta attēls.
Mikroskopa sastāvdaļas var iedalīt optiskajās un mehāniskajās komponentēs. Svarīgākās optiskās komponentes ir objektīvs, okulārs un kondensors. Objektīva pamatfunkcija ir savākt gaismu, kas nāk no parauga, un projicēt tā attēlu mikroskopa tubusā. Objektīvs ir galvenā mikroskopa komponente, kas nosaka tā veiktspēju, tādēļ to nereti veido sarežģīta daudzu lēcu sistēma. Tās uzdevums ir novērst tādus optiskus defektus kā, piemēram, hromatiskas un sfēriskas aberācijas. Pieaugošas sarežģītības secībā sīkāk iedala ahromatiskus (achromatic), fluorīda (fluorite) un apohromatiskus (apochromatic) objektīvus. Objektīvus var klasificēt arī sausā tipa un imersijas objektīvos. Pirmajā gadījumā starp objektīvu un segstikliņu atrodas gaiss, bet otrajā – vide ar lielāku gaismas laušanas koeficientu. Svarīgākie objektīvu raksturlielumi ir palielinājums un skaitliskā apertūra (numerical aperture, NA). Objektīva palielinājums ir skaitlisks lielums, kas raksturo, cik reižu objektīva projicētais attēls ir palielināts attiecībā pret priekšmetu. Kopējo mikroskopa palielinājumu nosaka, sareizinot objektīva un okulāra norādītās palielinājumu vērtības. Skaitliskā apertūra ir bezdimensionāls lielums, kas raksturo optiskas sistēmas spēju savākt gaismu un nosaka tās izšķirtspēju d.
Releja kritērijs.
Mikroskopa izšķirtspēja raksturo mazāko attālumu, kādā var izšķirt divus punktus. Izteiksmē parādās fundamentāls ierobežojums maksimālajai izšķirtspējai, ko var sasniegt optiska sistēma gaismas viļņējādās dabas dēļ. Ņemot vērā, ka redzamās gaismas viļņa garums ir 400‒700 nm robežās, bet tipiskas skaitliskās apertūras vērtības ir ap 1, augstākā izšķirtspēja, ko var nodrošināt standarta gaismas mikroskops, ir aptuveni 200 nm.
Labas kvalitātes attēla iegūšanai ir nepieciešams spožs un vienmērīgs parauga apgaismojums. Vienkāršākajos mikroskopos par gaismas avotu var kalpot dabīgā gaisma, kamēr modernos mikroskopos tiek izmantotas mikroskopā iebūvētas apgaismošanas ierīces. Zem pētāmā objekta atrodas kondensors – lēcu sistēma, kas savāc starojumu no gaismas avota un vienmērīgi koncentrē parauga plaknē. Visas mikroskopa optiskās, elektriskās un mehāniskās komponentes tiek izvietotas stabilā statīva konstrukcijā. Pētāmais paraugs jānovieto uz priekšmetgaldiņa, kura pozīciju var kontrolēt ar fokusēšanas mehānisma skrūvēm. Statīva augšdaļā ir pievienots tubuss – cilindriska caurule, kas atdala objektīva un okulāra lēcu sistēmas, nodrošinot nemainīgu attālumu starp tām. Optiskie mikroskopi var būt aprīkoti ar mehānisku revolverierīci ātrai objektīvu nomaiņai mikroskopēšanas laikā. Digitālos mikroskopos svarīga komponente ir gaismas detektori, piemēram, lādiņa saites matricas (charge coupled device, CCD) vai komplementārie metālu oksīdu pusvadītāju (complementary metal-oxide semiconductor, CMOS) sensori.
Viens no problēmjautājumiem mikroskopijas pētījumos ir strukturālu nianšu atšķiršana caurspīdīgos paraugos, kuros krītošās gaismas izkliedes un absorbcijas efekti ir nelieli. Optiskā kontrasta palielināšanai mikroskopos var izmantot to, ka gaismas vilni raksturo ne tikai amplitūda, bet arī polarizācija vai fāze. Polarizētās gaismas mikroskopi tiek papildus modificēti ar filtriem, kas laiž cauri lineāri polarizētu gaismu (polarizatoriem un analizatoriem), kamēr fāžu kontrasta mikroskopos paraugā radītās nelielās fāžu nobīdes ar dažādiem elementiem tiek pārveidotas gaismas intensitāšu variācijās. Mūsdienās pētniecībā plaši izmanto fluorescences mikroskopus, kuru darbības pamatā ir parauga fotoluminiscence ultravioletā starojuma iedarbībā. Šādos mikroskopos papildus nepieciešami monohromatiski un augstas intensitātes ierosinošā starojuma avoti (ksenona vai dzīvsudraba tvaiku lampas, lāzeri), kā arī dihroiski spoguļi un filtri dažādu viļņa garumu starojumu atdalīšanai. Fluorescenci var mērīt no visa parauga vienlaicīgi vai arī ar speciālu diafragmu palīdzību veikt pakāpenisku parauga skenēšanu. Otrā pieeja ir konfokālo gaismas mikroskopu darbības pamatā, kas ļauj veikt parauga mikroskopēšanu trijās dimensijās.
Optiskā mikroskopa realizācijas variantu shematiski attēlojumi: a) R. Huka izmantotais saliktā tipa mikroskops; b) A. Lēvenhuka vienkāršais mikroskops; c) fluorescences mikroskops; d) konfokālais mikroskops.
Attēla veidošanās shēma vienkāršā mikroskopā.
Palielināta attēla iegūšana ar optisko mikroskopu.
Ierīces pielietojums zinātnē, pētniecībā
Zinātnes nozare, uz kuru mikroskopa izgudrošana ir atstājusi vislielāko ietekmi, ir bioloģija. Ar pirmajiem gaismas mikroskopiem veikti organisma struktūras pamatelementu (šūnu) un mikroorganismu (vienšūņu un baktēriju) atklāšana. Attīstoties mikroskopu optisko sistēmu kvalitātei, zinātniekiem pavērās iespējas ielūkoties šūnu iekšējā struktūrā. Mūsdienās optiskie mikroskopi progresējuši tik tālu, ka ir iespējama atsevišķu molekulu vizualizēšana reālā laikā, kas ļauj veikt dinamisku procesu pētījumus dzīvās šūnās. Tādējādi optiskais mikroskops ir neatņemams instruments moderno bioloģijas un medicīnas zinātņu nozaru pētījumos. Gaismas mikroskopus plaši izmanto materiālzinātnē dažādu paraugu mikrostruktūras un defektu raksturošanā, kā arī ģeoloģijā minerālu kristāliskās struktūras un orientācijas noteikšanai.
Ierīces pielietojums tautsaimniecībā, ražošanā
Gaismas mikroskopi ir lieliski materiālu un ierīču kvalitātes kontroles rīki tādās nozarēs kā materiālu inženierijā, mikroelektronikā un nanotehnoloģijās. Optiskos mikroskopus izmanto medicīnas iestādēs slimību diagnostikā un ķirurģisku procedūru veikšanā, kā arī kriminālistikā nozieguma vietas vai pierādījumu analīzē.
Nozīmīgākie ražotāji
Nozīmīgākie optisko mikroskopu ražotāji ir “Carl Zeiss”, “Leica Microsystems”, “Meiji Techno”, “Nikon Instruments”, “Olympus”.
Mūsdienu atklājumi, problemātika
Klasisko gaismas mikroskopu telpisko izšķirtspēju līdz dažiem simtiem nanometru ierobežo gaismas difrakcijas parādība. Progress tuvā lauka optikā un uz fluorescenci balstītu attēlveidošanas metožu izveidē mūsdienās ļāvis pārvarēt difrakcijas robežu. Uzlabojumi gaismas mikroskopu optikas un elektronikas sistēmās ļauj ne tikai detalizēti aplūkot mikroskopiskas struktūras, bet arī novērot to izmaiņas laikā. Aktuāls jautājums ir izveidot kombinētus gaismas mikroskopus, ar kuriem būtu iespējams gan vizualizēt mikrostruktūras, gan veikt nanomēroga manipulācijas ar tām. Tālāk attīstoties mikroskopu telpiskajai un laika izšķirtspējai, kā arī selektīvai ķīmisko elementu jutībai, nākotnē varētu būt iespējams detalizētāk spriest par fizikālajiem, ķīmiskajiem un bioloģiskajiem procesiem, kas ir dzīvības norišu pamatā.
Multivide
Optiskais mikroskops.
Releja kritērijs.
A. Lēvenhuka vienkāršais mikroskops (kopija).
Attēla veidošanās shēma vienkāršā mikroskopā.
Palielināta attēla iegūšana ar optisko mikroskopu.
Optiskā mikroskopa realizācijas variantu shematiski attēlojumi: a) R. Huka izmantotais saliktā tipa mikroskops; b) A. Lēvenhuka vienkāršais mikroskops; c) fluorescences mikroskops; d) konfokālais mikroskops.