No 1500. līdz 1508. gadam Leonardo dzīvoja Florencē (ar pārtraukumu 1502. gadā, kad viņš bija Čezāres Bordžijas (Cesare Borgia) dienestā kā militārs inženieris un arhitektūras darbu konsultants). Florencē Leonardo bija iesaistīts atsevišķu inženiertehnisku darbu veikšanā, bet šis periods ir nozīmīgākais Leonardo kā gleznotāja darbībā.
Ievērojamāko perioda darbu vidū ir “Madonna ar vārpstiņu” (Madonna dei fusi, ap 1499; izmēros nelielais darbs zudis, zināmas vairākas tā kopijas), kā arī “Sv. Anna ar Dievmāti un bērnu” (Sant'Anna con la Vergine e il Bambino, arī Sant'Anna Metterza, 1503–1519, Luvras muzejs), kuru Leonardo bija aizsācis vēl Milānā (visticamāk pēc Luija XII, Louis XII, pasūtījuma, pie kura turpināja strādāt līdz pat mūža beigām). Ar šo gleznu saistīts arī vienīgais zināmais Leonardo lielizmēra zīmējums (tā dēvētais Burlingtonas nama kartons, The Burlington House Cartoon) “Dievmāte ar bērnu, Sv. Annu un mazuli Sv. Jāni Kristītāju” (The Virgin and Child with Saint Anne and the Infant Saint John the Baptist, 1499–1500, Nacionālā galerija, Londonā). Izsmalcināti niansētā zīmējuma kompozīcija atšķiras no gala versijas gleznā, kurā piramidāli kārtotā figurālā kompozīcija gleznota uz fantastiskas, bezgalīgas kalnu ainavas fona, radot gandrīz trīsdimensionālu efektu. Tēlu psiholoģiskā raksturojuma dziļums, tēmas simbolika, līdz pilnībai izkoptā sfumato tehnika padara šo darbu par vienu no augstās renesanses ietekmīgākajiem sasniegumiem.
Otrā Florences periodā sākts arī pazīstamākais un visvairāk interpretētais portrets pasaules mākslas vēsturē Lizas Gerardīni (Lisa Gherardini), Frančesko del Džokondo (Francesco del Giocondo) sievas, portrets, kas pazīstams ar nosaukumu “Mona Liza” (Mona Lisa, arī “Džokonda”, itāļu La Gioconda, franču La Joconde, ap 1501–1519, Luvras muzejs). Šajā portretā māksliniekam izdevās panākt tādu sfumato tehnikas perfekciju, tēla un fona ainavas telpisko vienotību un līdzsvarotu majestātiskumu, kas individuālajam portretam piešķir arhetipisku nozīmi. Noslēpumainais smaids sievietes sejā, iespējams, ir itāļu vārda gioconda ‘jautrs, dzīvespriecīgs’ vizuāla reprezentācija. Darbs netika atdots pasūtītājam, un tika pilnveidots līdz pat mākslinieka dzīves beigām. Iespējams, ka otrajā Florences periodā Leonardo aizsāka šādus darbus (kurus turpināja vēlāk): “Svētais Jānis Kristītājs” (San Giovanni Battista, 1508–1519, Abū Dabī Luvras muzejs, اللوفر أبوظبي, Louvre Abu Dhabi), hipotētiski tiek minētas arī divas kompozīcijas “Leda ar gulbi” (Leda col cigno, zināmas tikai skices, kas darinātas no 1503 līdz 1510 un kopijas), “Pasaules glābējs” (Salvator Mundi, ap 1500, autorība tiek apšaubīta, privātkolekcijā Abū Dabī).
Laika posmā no 1503. līdz 1506. gadam kuru Leonardo strādāja pie monumentāla gleznojuma pēc Florences pilsētas valdības pasūtījuma “Kauja pie Angiari” (Battaglia di Anghiari) vienā no Palaco Vekio (Palazzo Vecchio) centrālajām zālēm. Gleznojums palika nepabeigts, vēlāk tas zudis. Kompozīcijas centrālā daļa zināma pēc kopijām, saglabājušies atsevišķi zīmējumi un skices.
Kopš 1506. gada Leonardo ar Florences pilsētas valdības atļauju pēc Milānas franču pārvaldnieka uzaicinājuma epizodiski uzturējās Milānā kā militārais inženieris arhitekts, bet 1508. gadā pārcēlās uz Milānu.